活生生的颜色——荧光蛋白的明亮世界

荧光蛋白可以照亮细胞的内部运作，但正如安迪·Extance发现的那样，制造它们需要努力和运气

当乔舒亚•赛恩斯一只带有红色荧光神经元的转基因小鼠与另一只带有绿色荧光神经元的转基因小鼠交配后，产生了不止一窝具有花哨大脑的幼崽。Sanes是美国哈佛大学的一名研究人员，他不仅看到了绿色和红色的神经元，一些神经元同时产生了两种颜色，因此呈现出黄色——这让他成为了博士后琼Livet一个主意。他意识到细胞可以产生不同数量的多种颜色，混合产生中间颜色。据桑恩斯说，“天才之笔”是利用马赛克效应来更容易地标记和研究难以区分的细胞。Livet和Sanes的团队在2007年首次发表了该系统，该系统故意通过基因工程将这种效果的优化版本植入小鼠神经元，并将该技术称为“脑bow”。¹

这是一个引人注目的例子，表明研究人员试图利用荧光蛋白结构来精确地揭示细胞的功能。自1962年从生物发光水母中分离出绿色荧光蛋白(GFP)以来Aequorea victoria用其诡异的色彩照亮了许多生物。然而，尽管荧光蛋白赢得了2008年诺贝尔化学奖在美国，大多数寻求报告生物、生化和生物物理活性的复杂荧光探针都取得了微弱的成功。Sanes承认，即使是Brainbow的最初版本，现在已经是第三代了，“可能也没有我们想要的那么容易使用”。但由于不断的努力，今天的蛋白质探针越来越多地树立了一个光辉的榜样，通常——就像利维特和桑恩斯的例子一样——很大程度上是偶然的。

Brainbow植入基因指令，使三到四种不同颜色的荧光蛋白进入特定的细胞类型。每个细胞产生每种蛋白质的数量随机变化，这意味着大约产生100种颜色。因此，脑弓非常适合细长的神经元细胞，塞内斯解释道。他说:“如果神经元去了不同的地方，你就可以跟踪每一个神经元。”例如，这种方法已经帮助展示了视觉系统是如何连接的。另一个常见的用途是观察动物生长过程中的细胞分裂。萨内斯说:“假设你有17个细胞，它们有17种不同的颜色，等到你有1700个细胞时，它们仍然只有17种不同的颜色。”通过观察，你可以学到很多关于发展的知识。”

现在许多实验室都成功地使用了Brainbow，这在一定程度上要归功于他的团队解决了许多着色难题。特别是Brainbow的第一个版本“在很多情况下都不够聪明”。“因为你用了不同的颜色，每种颜色都不那么明亮，”桑恩斯解释道。解决这个问题是可能的，因为GFP的发现引发了哈佛研究人员所说的“革命”，揭示了广泛的可能的荧光蛋白。他说，虽然他的团队可以选择最亮的蛋白质，但“拥有更亮的蛋白质仍然很好”。

红色警报

其他科学家正试图提供帮助。对许多人来说，主要目标是GFP中238个氨基酸中的3个，它们在氧气存在时自发反应形成双环发色团。蛋白质的其余部分围绕着携带三种关键氨基酸的单一蛋白质线形成桶状形状，这种排列有利于荧光发色团的形成。在这种结构被破译后的20年里，研究人员已经在告诉生物体产生这种蛋白质的遗传密码中进行了小的突变。除了这些改变GFP光谱特性的努力的结果，Sanes强调，他的团队也从其他荧光生物蛋白质的研究中受益。

红色荧光蛋白长期以来一直是蛋白质工程师和猎人高度珍视的目标。在显微镜下，与其他颜色相比，活体组织对红光的吸收和散射更少，红光对组织的伤害和激发不必要的荧光也更少。然而，与当今最好的增强型绿色荧光蛋白所提供的绿色相比，现有的深红色蛋白质通常是暗淡的，更容易被光分解。尽管来自其他生物的蛋白质也具有与GFP相同的桶状结构，但它们的发色团环通常不太容易形成。

乌尔里希Nienhaus德国卡尔斯鲁厄理工学院(Karlsruhe Institute of Technology)的教授就是其中之一，他们正在寻求新的、改进的替代方案。在一起Jorg Wiedenmann来自英国南安普顿大学的尼恩豪斯发现，在气泡尖海葵中Entacmaea quadricolor四个相同的蛋白质分子聚集在一起产生红色荧光。然而，当添加到其他蛋白质上时，这种四聚体形成序列会导致不必要的聚集，损害科学家想要研究的功能。

为了生产一种更有用的蛋白质，尼恩豪斯、维登曼和他们的同事进行了一系列的突变。首先，他们制造出了一种明亮的发出红色的非聚集性单体蛋白mRuby。在此基础上，他们开发出了mGarnet，其亮度与其他红色荧光蛋白相似，但仍不如GFP。²它在光照下非常稳定，这对另一项获得诺贝尔奖的技术尤其重要2014年受刺激发射耗竭(STED)超分辨率显微镜．为了提供最小尺度的图像，STED使用一束聚焦的激光束来激发荧光蛋白，第二束甜甜圈状激光束熄灭第一个光点边缘的荧光。在样品上扫描光束可以得到高分辨率的图像。这意味着蛋白质会被激发和淬灭多次，反过来，它们的弹性是至关重要的。

mGarnet和mRuby之间的氨基酸序列差异只有4个残基，但研究人员必须产生300多个不同的突变体才能发现它。尼恩豪斯承认:“我们还没有多少控制力。”他说，这是反复试验。我们正在尝试修改那些已经被证明对其他荧光蛋白有效的东西，但这可能会完全失败。我们仍然不能很好地理解蛋白质支架和发色团之间的相互作用，从而能够预测这种合理的工程方法的结果。”

输入伏特

在科学家用来研究细胞的蛋白质探针的进步中，财富的这种突出作用很常见。另一个例子是蛋白质传感器，它检测细胞内的电压，通过荧光强度报告读数。直到2012年，最好的这种系统提供的荧光变化太小，反应时间太慢，不容易被利用。

电压生物传感器刚刚开始变得足够好用

劳伦斯•科恩

尽管如此,Lei金为了研究使用不同荧光蛋白的效果，美国耶鲁大学的一名研究人员试图将其改造成一种她可以在实验室中可靠生长的细胞系。她不仅成功地做到了这一点，而且细胞在电压驱动下产生的荧光变化至少是以前所见过的5倍。^3.他解释说，这种改善要归功于细胞系中的“一次幸运的自发突变”劳伦斯•科恩他是金勇所在小组的负责人。他希望这种被称为ArcLight的新型传感器能够帮助科学家在不需要电极的情况下测量某些重要生物过程的核心电位。

科恩说:“你可以用相机在多个细胞中同时看到电位，这是用电极很难做到的。”“你可以更好地测量心脏和大脑的活动。蛋白质电压传感器的特殊之处在于，你可以让它们出现在特定的细胞类型中。例如，在视网膜中，大约有100种不同的细胞类型。如果你想知道单个细胞类型是如何参与产生输出的，那么你需要一个蛋白质传感器，你可以出现在每种细胞类型中，一次一个，而不是有机染料，每个细胞都被激活并与之结合。”

科恩说，多亏了ArcLight等技术的进步，“电压生物传感器才刚刚开始变得足够好，可以用于”这类应用。但他补充说，“直到最近，没有人知道”电压是如何影响蛋白质的荧光的，因此进一步的改进目前是一个重大的挑战。

离子排除缺陷

然而，这样的改进正是我们要做的艾米·帕尔默来自美国科罗拉多大学的研究人员想要看到。她解释说:“仍有大量传感器没有被广泛使用，可能是因为它们对非专业人士来说不够强大。”

帕尔默强调，通过优化努力，已经出现了一些值得注意的成功故事。她认为最成功的是被称为GCaMP的单荧光蛋白钙传感器，由弗吉尼亚州霍华德休斯医学研究所珍妮利亚农场校区的研究人员优化。GCaMP最初是在2001年使用GFP和钙结合蛋白钙调蛋白等成分开发的，现在已经是第六代了。⁴当钙不存在时，结合的蛋白质是黑色的，当钙存在时，结合的蛋白质是荧光的。

帕尔默说:“这些传感器现在非常强大，可以为大量研究人员工作。”她补充说，GCaMP在监测分子与细胞表面蛋白质结合等事件时特别有用，这些事件会引发细胞内钙离子浓度的暂时“短暂”变化。“这些改进是我们努力优化信号、提高稳定性、确保传感器在各种模式生物中发挥作用的结果。”

GCaMP是Palmer团队用来测试他们正在开发的蛋白质钙传感器的一种方法。当两个荧光蛋白靠近时，其中一个荧光蛋白的发射光谱与另一个荧光蛋白的激发光谱相匹配，可以通过荧光共振能量转移(Fret)直接相互作用。加上蛋白质的离子感应部分，这样的对可以报告浓度的变化。当钙离子结合时，Fret传感器蛋白的构象发生变化，增加能量转移，并使接收能量的蛋白质发出明亮的荧光。

“Fret传感器可以用来量化细胞中的分子和离子，”帕尔默解释道。除了钙，她的团队还在研究锌离子监测器，使用青色和黄色荧光蛋白。⁵她补充说:“我们和其他人已经开发了一个包含多种传感器的工具箱。”“这些研究让我们对细胞质中的锌有了可靠的估计，并提出了关于细胞如何利用和调节锌的新假设。”

帕尔默说，这可能有助于扩展细胞中的金属离子在不同刺激下以确定和可测量的方式变化的发现。她说:“例如，当卵母细胞(卵细胞)被精子受精时，已知会产生钙信号。”“随着每一个钙信号，锌就会从卵母细胞中释放出来。目前还不清楚锌在起什么作用，但这是相当惊人的，所以现在科学界正专注于如何解读这些动态。”

听天由命

帕尔默的工作依赖于高通量的方法来全面成像细胞反应的全部范围和设计新的传感器系统。在未来，她热衷于使用这种方法来改善荧光蛋白的生物物理特性，包括在状态之间切换。她说:“如果我们能弄清楚是什么控制开关时间或大小，我们也许就能针对不同的应用对它们进行优化。”

荧光蛋白在不同颜色之间切换的原型源于另一次偶然的发现Yoshikazu Imanishi来自美国俄亥俄州凯斯西储大学。他解释了宫崎敦在日本埼玉理化研究所的团队如何试图从石珊瑚中提取一种新的绿色荧光蛋白，Trachyphyllia geoffroyi．⁶Imanishi说:“他们把这种绿色荧光蛋白放在长凳上，第二天他们发现它已经从绿色变成了红色。”“他们决定将其命名为kaede，在日语中是枫叶的意思，因为枫叶也会由绿变红。”

Kaede的颜色变化是由紫外线引起的，因此它被称为光可转换蛋白，此后人们开发了更多的光可转换蛋白。Imanishi的团队对动物进行基因工程改造，将这种探针组添加到特定的蛋白质上，并跟踪它们在特定细胞中的行为。一种可能性是研究蛋白质在制造后发生了什么。他说:“我们可以将细胞中的所有蛋白质转化为红色，之后所有新产生的蛋白质都变成绿色，所以我们可以很容易地看到它们。”

显微镜已经有300年的历史了，但在过去的6年里有了巨大的发展

劳伦斯•科恩

凯斯西部大学的科学家们这样做是为了观察蛋白质的运动，并测试肌动蛋白是否参与了在细胞周围携带关键蛋白质的过程。⁷Imanishi说:“肌动蛋白是一种运动蛋白的高速公路，它可以运输含有膜蛋白的小泡。”“我们用化学方法破坏了肌动蛋白丝，并监测了循环gmp门控通道和g蛋白偶联受体的运输。我们发现g蛋白偶联受体可以进入它应该在的特殊膜室，但循环gmp门控通道不能进入质膜。一种转运机制依赖于肌动蛋白，而另一种则不是。”

可切换荧光蛋白使另一种获得2014年诺贝尔化学奖的超分辨率显微镜方法——光激活定位显微镜(Palm)成为可能。该方法可以使用绿色荧光蛋白，例如，可以从关闭切换到打开，或者不可逆地激活。Imanishi说:“观察单个荧光蛋白只需要非常少量的这种蛋白质，因为如果两种荧光蛋白结合在一起，它们就很难分解。”“我们的想法是以重复的方式激活非常少量的荧光蛋白，以重建许多单分子的分布，分辨率低于衍射极限。”

考虑到科恩引用了导致超分辨率的历史来预测蛋白质传感器的未来可能是什么，现代显微镜技术的参与是合适的。他说:“显微镜已经有300年的历史了，但在过去六年中有了巨大的发展。”“如果你付出努力，事情就会变得更好——这是一个普遍现象。人们将致力于制造蛋白质传感器，经过很长一段时间，它们会变得更好。我预计蛋白质传感器的发展还会持续几个世纪。”

安迪Extance是一位生活在英国埃克塞特的科学作家