生物正交革命

很少有研究能像一项研究那样，如此迅速地从想法转变为现实Carolyn Bertozzi实验室的一个特别项目在21世纪初。但有时候，事情就是这样。当Bertozzi突发奇想时，该团队正在寻找新的反应，可以用来选择性地标记活细胞内的目标生物分子。

当时还是贝尔托齐加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)研究小组研究生的珍妮弗•普雷彻(Jennifer Prescher)说，我从来没有收到过类似的论文。她说:“评论就像是‘立即发布’。”“这个概念随后推动了该领域的大量工作。”

今天，这一概念已经被广泛应用于人类。菌株驱动的生物正交化学目前正在首次人体临床试验中进行测试，该试验是一种实验性抗癌疗法，可选择性地在肿瘤部位释放药物。

普雷舍尔说，20年前，生物正交化学的概念还不存在，他从2010年开始领导加州大学欧文分校的一个实验室。“现在，其中一些化学物质已经被用于人体。”

我可以点击它吗?

有机化学家的圆底烧瓶中精心策划的反应条件与活细胞内的环境没有太大的不同。去除精心干燥的有机溶剂，惰性气氛，合适的温度和高度纯化的反应物和试剂。在它们的位置，加入一份温热的含有离子和分子的水基汤，这些离子和分子具有化学活性。

在生物系统中，我们如何操纵生物分子存在空白。这就是生物正交化学开始出现的原因

生物正交化学是发现和应用的反应，即使在这些条件下，也会迅速和选择性地进行，而不会扰乱周围的生物化学喧嚣。

北京大学(Peking University)化学生物学研究员彭晨(音)说，随着化学和生物学知识的增长，人们自然而然地开始在界面上工作，探索前沿。“我们仍有一些空白，特别是在如何在生命系统中操纵生物分子方面。这就是生物正交化学开始出现的原因。”

研究能够在生命系统中悄然发生的反应的最初动机是开发化学工具，以研究分子细节上的生物过程。以前，蛋白质可以通过基因编码来结合绿色荧光蛋白或其变体来进行原位研究。但是这些标签很笨重，可能会改变结果。而且只研究蛋白质忽略了对细胞生物学和疾病同样至关重要的其他多种生物分子。

贝尔托齐的实验室于2015年搬迁到斯坦福大学，长期以来一直对细胞表面糖以及与感染、炎症和癌症相关的糖基化变化模式感兴趣。生物正交化学，以两个小分子在细胞环境中相互反应形成新的共价键的形式，代表了解决这个问题的一种方法。其中一个可以连接到一种感兴趣的糖上，另一个可以连接到一种化学报告器，如荧光标签。当两个合作伙伴一起时，标记的糖可以在其原生环境中进行研究。

这种连接反应的早期尝试通常涉及羰基，但由于与细胞中天然存在的含羰基代谢物的交叉反应而受到限制。2000年，Bertozzi发表了这项工作可以说是开创了生物正交领域她对三芳基膦和有机叠氮化物之间古老的Staudinger反应进行了曲解，这两个官能基团在哺乳动物细胞中没有发现。经典的Staudinger会产生一种不稳定的aza-ylid，它很容易在水的存在下水解。在新版本中，Bertozzi将甲酯加入到三芳基膦中，使氮杂环在分子内环化。由此产生的酰胺键稳定地将两种起始材料连接在一起，使细胞表面糖的选择性标记成为可能。

是的，你可以

“我在Staudinger结扎法发表后就加入了实验室，”Prescher说。“我本以为我会去研究生院研究天然产物全合成，然后在一次研究生招生活动中，我遇到了一位年轻的有活力的教授，他有我认为非常酷的想法。”

普雷舍尔的博士项目旨在利用这种新的化学方法来探索非天然糖作为潜在的癌症疫苗。她说:“事实证明，关于这些非天然糖的代谢及其在细胞表面的呈现，还有很多东西要学。”“我们开始思考，我们能在活的动物身上想象这些改变的糖基化形式吗?””

利用Staudinger结扎化学，该团队在一只活老鼠体内进行了第一次生物正交反应。“我们能够在动物体内进行反应，”普雷彻说。“但它太慢了，我们无法用它来成像。”For whole animal studies, the Staudinger’s slow reaction rate meant having to inject a lot of reagent to drive the reaction forward, which caused the problem of unbound probe lighting up. A new approach for whole animal studies was going to be needed.

大约在同一时间，其他具有生物正交前景的化学物质开始出现。最典型的咔哒反应，即铜催化叠氮烷环加成(CuAAC)，于2002年由Meldal和Sharpless实验室首次发表。遵循选择性、高产率和广泛范围的化学反应最初被设想为有机合成的工具。但是，如果点击反应涉及的官能团与细胞中通常发现的官能团完全不同(正交)，那么点击反应可能非常适用于生物学应用。在哺乳动物研究中，叠氮化物和炔烃属于这一类。

难道张力的炔会如此活泼以至于不需要铜了吗?

与Staudinger的反应一样，CuAAC是对旧反应的新转变，基于催化铜能将反应速度加快1亿倍的发现。普雷彻说:“这吸引了很多人的注意力。”这个反应特别有趣，因为它涉及两个小的官能团，可能更容易合并，而不会破坏待标记生物分子的自然过程。但这种化学反应也不能立即应用于活体动物成像。原来的铜催化剂在细胞中产生了毒性水平的活性氧。她说:“在一种动物身上，三种东西需要汇聚在一个区域是很困难的。”

但无铜的咔嗒反应可能会奏效。普雷彻说:“那天晚上很晚的时候，我碰巧在实验室里，卡洛琳从一个物理学会的会议上回来了，她正在谈论刚才讨论过的这些古怪的张力分子。”难道张力的炔会如此活泼以至于不需要铜了吗?这个小组去了图书馆，寻找先例。“我们遇到了这篇论文仍然是德文她说，但你可以读到叠氮苯(phenyl azide)、环辛(cycloclooctyne)和爆炸(explosion)。当你想要增加一点反应速度的时候，这是一个很有前途的短语。

线性炔的键角为180°，但在环炔(通常可隔离的最小应变炔)中，循环结构将键角弯曲至160°，有利于反应过渡态的扭曲。应变基板证明高度适应无铜点击化学。“我们制造了这种分子，在蛋白质上进行了测试，然后在细胞上进行了测试，就在几个月的时间里，”普雷彻说。

在快速开发和发表最初的无铜点击生物正交反应后，该团队探索了进一步提高反应速率的方法，包括在环辛中添加氟取代基。杰里米·巴斯金(Jeremy Baskin)回忆说:“在(Bertozzi的)实验室里，那真是一段令人兴奋的时光。”巴斯金目前在纽约康奈尔大学(Cornell University)工作，他自己在该组的博士工作专注于开发具有更快反应动力学的新环辛试剂，并将其应用于特定的标记反应。Bioorthogonal-based成像在有生命的有机体成为可能．“在斑马鱼成像实验中，我们可以看到聚糖在细胞表面被标记，然后通过内吞作用内化，并被运送到细胞中的不同细胞器，”巴斯金说。

承受压力

约瑟夫·福克斯开始了他的传统有机化学家的职业生涯，他对张力分子的化学特别感兴趣。当Bertozzi的团队发表了第一篇关于应变驱动生物正交化学的论文时，Fox已经在美国特拉华大学有了一个充满应变分子的实验室。“我正处于开始探索这种化学反应的理想位置，”福克斯说。

福克斯熟悉的一个反应是应变烯烃和四氮之间的逆电子需求Diels-Alder反应，该反应以其异常快速的动力学而闻名。这两个官能团都不是在哺乳动物细胞中天然存在的，这表明存在生物正交的潜力。2008年，福克斯和他的团队发表了四氮氮与跨环辛的生物正交反应(TCO)。四嗪连接仍然是最快的生物正交反应，随后Fox基于计算机辅助构象分析设计了双环环辛烯-环丙烷体系。“三元环不仅增加了张力，它还使环皱成一种不自然的构象，使双键更活跃，”福克斯说。“对于反应性最强的反式环辛素，其反应速率大于330万M¹年代¹-真快!”

Prescher的小组是后来对这种化学反应做出贡献的小组之一，他们表明环丙烯是最小的环张力二嗜性分子，可以参与四氮连接。普雷彻说:“我总是从非哺乳动物生命中发现的功能基团中受到启发。”“它们能制造人类无法制造的多种分子。环丙烯是许多微生物天然产物的一部分，因为它们存在于这些生物体中，你知道它们至少有一定程度的代谢稳定性，所以可能是一个很好的起点。还有相当多的多样性，等待着以这种方式加以利用。”

在Fox实验室，一个重点是改善对tco的访问。福克斯说:“制造张力分子的化学过程相当专业，但实际上已经被广泛采用，我认为这说明人们是多么渴望这些分子。”团队的光化学流法制备TCOs已经被世界各地的组织采用。“这是一个非常独特的闭环反应器，你可以在线捕获产品，使用亲和层析，来驱动一个不利的平衡。”

最近的工作是与辉瑞公司合作进行的。福克斯说:“他们感兴趣的是研究药物作用于蛋白质靶标后会发生什么，以及时间的函数。”2022年初，该团队发表了光激活版的四氮氮结扎这为蛋白质成像提供了时间和空间上的控制。“你有一种不反应的前体二氢四嗪，在光催化剂的作用下，你可以打开它，”福克斯解释道。“你可以用非常高的分辨率聚焦光线，进行一种光刻技术，在活细胞的细胞核内制作图案或书写字母。我们想用它来研究生物分子运动在活细胞环境下的实时功能。”

正确的工具

除了基于菌株的反应和Staudinger连接，用于CuAAC咔哒反应的生物友好型铜催化剂已经开发出来，其特征是水溶性配体，可以稳定金属并抑制活细胞或动物中ROS的形成。叠氮化物和芳基碘化物之间的钯和钌偶联反应也得到了应用。

脂质细胞生物学是生物正交化学的沃土

Prescher说，开发一套生物正交化学是该领域成功的关键。“我喜欢把这些反应看作是跨越化学光谱的反应，只要我们知道如何使用它们以及它们的优缺点，这就很重要。”

在Baskin的实验室中，一系列的生物正交化学被应用。他说:“在我的职业生涯中，我已经从一名生物正交探针的开发者转变为一名用户，在过去的20年里，我们确实利用了反应开发的优势。”在博士期间研究了细胞表面糖之后，巴斯金对构成细胞膜的脂质产生了浓厚的兴趣。他说:“脂质细胞生物学是生物正交化学的沃土。”

丰富的磷脂是生物膜的主要结构元素，微量膜磷脂在细胞信号传递中发挥作用。巴斯金说:“我们对一种叫做磷脂酸(PA)的信号脂质很感兴趣。”他说:“在许多癌症中，它的产生上调，在细菌和病毒感染期间，它的产生被诱导，在神经退行性疾病中，它的水平被改变。”“我们被这样一个问题所驱动:一种分子是如何有这么多不同的反应的?细胞是如何从所有这些反应中获得特异性的?”研究小组表示，空间和时间背景是关键。

你需要快速的生物正交化学来标记这些脂质

为了研究PA，巴斯金利用了制造PA的磷脂酶D (PLD)更喜欢酒精而不是水这一事实。该反应通常涉及PA脂质前体的水解，但为酶提供一个带有可点击手柄的主醇，它会将其附着在它制造的PA上。巴斯金说:“无论我们使用的是叠氮基还是炔基，甚至是跨环辛烷基，PLD仍然接受这些改性的伯醇。”

选择的可单击组取决于应用程序。对于亚细胞研究，如脂质运输，速度至关重要。巴斯金说:“脂质在细胞内移动的速度比人们想象的要快得多——它们在亚秒级的时间尺度上在双分子层内分解，在亚分钟的时间尺度上在不同的细胞器之间流动——所以你需要真正快速的生物正交化学来标记这些脂质在它们最初产生的地方。”为此，我们使用了逆电子需求Diels-Alder化学，即四氮连接。”

但对于在细胞水平上进行成像的应用，其他方法更适合。然后我们将使用叠氮环辛反应。在那里，因为酒精上的生物正交基团更小，我们可以得到更多的标签，”巴斯金说。在最近的一项研究中，该团队使用全基因组Crispr干扰随机敲除细胞中的基因，然后使用环西汀为基础的生物正交全细胞荧光成像来测量PLD/PA信号是如何受到影响的。巴斯金说:“我们发现了著名的癌症相关激酶GSK3和PLD途径之间的联系。”除了这种潜在的癌症联系，研究小组还确定了其他160个PLD/PA信号通路的假定调节因子。巴斯金说:“生物正交化学擅长拓宽你的视野，打开你的眼罩。”

在最近的另一个例子中，Bertozzi和她在斯坦福大学的同事Ryan Flynn使用了叠氮环辛无铜点击化学检测乙二醇rna-用糖装饰的rna -在活细胞表面。这一发现既挑战了rna在细胞中没有糖基化的观点，也挑战了rna在细胞表面没有发现的观点。

自由自在

生物正交键形成反应在活细胞和动物的生物偶联、标记和成像方面取得了巨大进展。但从化学的角度来看，成键反应只是故事的一半。“我们开始思考，为什么我们不能利用键分裂反应?”陈说。“卵裂型反应为激活蛋白质、释放药物提供了可能，我们需要一种生物相容性的按需方法。”

类似于有机合成中使用的功能基团去保护策略，Chen开发了一种蛋白质，其中活性位点的关键残留物被一种保护基团“囚禁”，以阻止蛋白质的活性。可以使用生物正交键断反应将笼子剪掉，解除对蛋白质的保护并将其打开。我们的第一个例子是在2014年钯介导的脱溶化学”彭说。钯从活性部位的笼状赖氨酸残基中裂解出氨基甲酸丙酯。“这是金属去保护生物分子的第一个例子，表明我们可以操纵活细胞中的蛋白质活性。”

Chen的实验室仍在研究金属蛋白脱膜技术。一个优点是金属可以用作光触发的光催化剂来启动脱老化。Chen说:“这种方法的美妙之处在于，你可以在细胞内的一个位置使用它，给你空间控制。”“我们最近的一篇论文使用光催化技术进行亚细胞蛋白质组分析。”

金属也为催化生物正交化学提供了潜力。“到目前为止，还没有人真正证明了这种反应在生命系统中的催化作用——由于细胞中的复杂性，我们甚至可能添加超过化学计量量的金属。”催化加载是我们正在探索的东西。”

无金属生物正交键断裂也已实现，主要是通过适应已证明为生物正交键形成的反应。2013年，荷兰Tagworks制药公司的Marc Robillard领导的团队表明TCO-tetrazine化学可以用于键断裂．如果氨基甲酸酯在烯丙基位置连接到TCO上，这个侧基将通过环加成引发的重排作为自由胺释放。研究小组表示，这种反应可用于在活细胞中按需释放抗癌药物阿霉素。

在肿瘤细胞内，我们可以用紫外线选择性地激活蛋白质

Chen使用了类似的TCO-tetrazine方法来去除蛋白质，如caspase 3，这是一种激活程序性细胞死亡的信号蛋白。陈说:“我们发现，这将在30-60分钟内引发细胞死亡。”“在这段时间内，我们确定了细胞死亡半胱天冬酶消化的底物，特别是那些早期事件。”

Chen表示，在治疗方面，化学允许“前药物”的概念——只在原位假设其活性形式的伪装疗法——从小分子扩展到包括蛋白质疗法。陈说:“人们能够制造小分子前药，因为与蛋白质相比，它们在小分子合成方面具有更好的可控性。”“现在我们对蛋白质也有这种能力。”The team has developed a computational tool to identify suitable lysine or tyrosine residues in or near the active site that will block protein activity until uncaged. In 2019, the team used this chemistry to阻断炭疽毒素中的关键催化残留物．Chen说:“在肿瘤细胞内，我们可以使用紫外线选择性地激活蛋白质。”其他诱因目前正在调查中。

小分子药物开发的先例表明该策略具有很强的临床潜力。“一些公司现在正在使用这种化学物质进行药物前应用，去年，一种小分子药物的生物正交脱膜反应在美国进入了临床试验。”这不仅显示了它在细胞中的前景，也显示了它在人类活体中的前景。”

2020年10月，总部位于加州的生物科技公司沙斯基首次在人类身上使用他开始了一种阿霉素前药的1/2期临床试验，该药物利用了福克斯开发和罗毕拉德改编的四氮- tco化学物质。治疗的基础是预先在肿瘤部位注射装载四氮氮的水凝胶，然后注入阿霉素前药。只有当两种成分在肿瘤部位相遇时，药物才会释放出来。

阿霉素用于治疗多种癌症，但常常受到毒副作用的限制。在小鼠中，前药物策略提高了可耐受剂量增加了近6倍，存活率增加了63%。临床试验尚未完成，但该公司已经完成了计划基于抗体的方法这样，注射无法到达的肿瘤仍然可以用四氮胺修饰。福克斯说:“这是第一个在人类身上进行的生物正交化学实验，看到这个故事的发展真是太棒了。”

詹姆斯·米切尔·克罗是澳大利亚墨尔本的科学作家