正如克莱尔·桑瑟姆发现的那样,质谱法不仅可以用于小分子,这意味着它是药物研发和医院的重要工具

质谱和蛋白质分析,使用液相色谱注射系统加载样品

来源:©Lewis Houghton/科学图片库

质谱法越来越多地用于蛋白质和其他生物样本

质谱仪已经有将近一个世纪的历史了。1913年,以发现电子而闻名的英国物理学家J·J·汤姆森(J . J . Thomson)让一束电离氖穿过电场和磁场,并用感光板测量了它的偏转。他发现光束一分为二,产生了两个点。他正确地得出结论,这些原子是由不同质量的氖原子组成的:同位素20.Ne和22不。1919年,他的学生、后来也是诺贝尔奖得主的弗朗西斯·阿斯顿(Francis Aston)在利兹建造了第一台基于质量和电荷分离原子物种的功能机器——第一台质谱仪。这种设计的基本原理至今仍在使用,质谱(MS)仍然是测定分子质量的最准确和精确的实验室方法。

质谱法的第一个实际应用是将原子分离成同位素,就像汤姆逊对氖所做的那样。在曼哈顿计划中,一种质谱仪被用于分离铀的同位素,并为“小男孩”制造浓缩铀,即摧毁广岛的炸弹。分子,尤其是大分子,面临着更多的挑战:如何在不破坏一些化学键的情况下使分子电离?几十年来,这限制了质谱测定“小”(和中型)分子的质量。

20世纪80年代发明的“软”电离技术允许大分子被电离并保持完整,使该技术成为测定像病毒衣壳一样大或像人类核糖体一样复杂的实体质量的主要技术。在过去的几十年里,人们开发了许多软电离技术,但基质辅助激光解吸电离(Maldi)和电喷雾电离(ESI)是应用最广泛的。分析质谱法有广泛的实际应用,比20世纪40年代的第一次军事应用要良性得多:在地球化学、环境和法医学,在药物发现管道的几个部分和临床医学中。

用于电喷雾电离质谱(ESI-MS)的纳米喷雾装置特写

来源:©Andrew Brookes,国家物理实验室/科学图库

“软”电离技术,如图中所示的电喷雾电离,用于制备样品而不破坏它们

矩阵的方法

基质辅助激光解吸电离技术是由Franz Hillenkamp和Michael Karas在20世纪80年代中期在德国发明的。日本工程师田中光一(Koichi Tanaka)更早一点描述了类似的技术,并因此获得了2002年诺贝尔化学奖,当时他才40岁出头,但Hillenkamp和Karas的技术已经成为标准。几十年来,马尔迪仪器的运作已经变得面目全非,但基本原理完全没有改变。它们包括将待测样品嵌入一个矩阵中,该矩阵吸收特定波长范围内的电磁辐射,通常是紫外线。用该波长范围内的激光照射基质及其嵌入的分析物,大部分能量被基质吸收,导致体积解体过程(即烧蚀而不是经典的解吸)。因此,分析物只获得少量内能,保持其完整。电离要复杂得多,根据给定的解吸/电离参数假设了几种理论。产生的离子被溅射到一个“质量分析器”中,根据它们的质荷比将它们分开:通常是通过在已知的电场中加速它们,并测量它们飞行到探测器的时间。

医院病理实验室的maldi -生物打印机(右)

来源:©畸变电影有限公司/科学图片库

Maldi -基质辅助激光解吸电离-是另一种广泛应用的软电离方法

然而,即使这些马尔迪技术对于许多生物学应用来说也不够柔软。在生物医学研究中最常用的337nm紫外线激光照射下,蛋白质复合物会分解,聚糖、磷酸盐和其他翻译后修饰物会从氨基酸中“脱落”。Rainer Cramer现在是英国雷丁大学的生物分析科学教授,他在希伦坎普位于明斯特和美国田纳西州范德比尔特大学的实验室读博士时,参与了使用低能量激光开发Maldi技术。他还记得质谱分析与美国国防能力之间的另一个联系。“当国会在20世纪90年代初关闭了有争议的“星球大战”战略防御计划时,它的许多设备,包括红外自由电子激光器,都被用于生物医学研究。我们用其中一个做Maldi仪器。“红外Maldi激光器足够柔软,可以使磷酸化和糖化蛋白在电离器中保持完整,但这些激光器仍然比普通的紫外线激光器贵得多,也更难使用。”

最精确形式的定量质谱将涉及几个质量测定步骤,由某种形式的分子物种的化学碎片分开。当样品是蛋白质时,最初的破碎步骤是简单的蛋白质水解。克拉默的小组正在开发这样的方案,用于分析血液和其他体液中的蛋白质,主要用于检测和诊断癌症。术语“自下而上蛋白质组学”适用于任何方法,在样品中的蛋白质在确定任何质量之前被分解为肽;如果这应用于从细胞中提取的粗蛋白质,它可以被称为“鸟枪蛋白质组学”,类似于鸟枪DNA测序。

迫切需要

卵巢癌是一种仍然非常需要精确的早期检测和诊断工具的疾病。它被称为“沉默的杀手”,因为早期症状是模糊和扩散的,因此,它通常只在治疗很少成功的晚期才被发现。在患有最常见的上皮性卵巢癌的女性中,约有四分之三的人血液中CA125蛋白的水平会升高。克拉默说:“CA125是卵巢癌最好的生物标志物,但它仍然不够好。”“质谱法可以在CA125酶联免疫吸附法和其他免疫方法的基础上添加其他生物标记物或生物标记物谱,但这只会带来轻微的检测改善,因为这种疾病相对罕见,除非特异性接近100%,否则假阳性将非常普遍。”

CA125是卵巢癌最好的生物标志物,但它仍然不够好

假阳性的癌症诊断会使患者感到痛苦,浪费宝贵的卫生资源,并推迟对更常见的疾病的诊断,这些疾病可能更良性,但仍然痛苦。理想情况下,我们需要更准确和精确的同时测量更多的生物标志物,以建立卵巢癌的蛋白质组学“信号”,而MS是用于此的理想技术。Cramer和他的同事正在开发快速检测体液中多种疾病生物标志物的方案;这些也有兽医学应用,包括从牛奶中诊断乳腺炎。Cramer说:“我们仍在研究多发性硬化症如何以及在哪里可以为临床诊断最广泛使用的技术增加价值,以提高准确性、敏感性和特异性。”

蛋白质质谱的应用很少进入临床,至少在常规应用中是如此。然而,对于更小的分子,情况就大不相同了。用于精确测量中小型分子的体积更小、价格更便宜的质谱仪,至少从世纪之交开始就经常出现在医院的分析实验室中。这些通常是LC-MS-MS机器,结合了液相色谱的分离设施和串联质谱的精确质量测定。直到最近,两种应用构成了他们工作的支柱:监测免疫抑制药物的浓度,以及血清或全血中维生素D及其代谢物的浓度。

在诊所里

东安格利亚大学的生物分析设施为诺福克和诺维奇大学医院服务,并从更广泛的领域接受合同分析,是大型教学医院的典型。自2011年以来,它一直由设施经理乔纳森·唐和高级研究员约翰·达顿在医学教授比尔·弗雷泽的全面指导下运营。达顿记得,当他在20世纪70年代开始他的分析化学家职业生涯时,许多相同的常规临床分析被要求。在此后的40多年里,他见证了检测的速度和通量以及所获得结果的精度方面的巨大改进。他说:“大约10-15年前,LC-MS-MS技术被引入到我们的工作中,带来了其中一些最显著的改进。”

然而,从分析科学家的角度来看,这种新工具有优点也有缺点。达顿说:“使用最新的常规临床分析仪,除了插入墨盒、按下按钮和记录测量结果之外,几乎没有什么可做的。”这些分析人员是机器人,有时科学家们会觉得他们自己也在变成机器人。我们通过让初级员工参与研究来激励他们。”

我们一直在开发的测试是选择性,特异性和快速的

刚毕业的妮可·鲍尔(Nicole Ball)就是这样一位初级科学家,她一直在实验室实习,准备攻读博士学位。在Tang的指导下,她开发了一种LC-MS-MS方法,用于检测和区分人血清中的皮质类固醇皮质醇和强的松龙。这些是治疗阿狄森氏病的主要方法,在这种病中,肾上腺无法产生足够的皮质类固醇,患者在治疗期间的类固醇水平需要持续监测。Tang说:“在英国,超过90%的糖皮质激素检测仍然使用免疫分析技术,这种技术的特异性不如MS,无法区分各种分子。”“我们正在开发的测试可以同时测量两种分子,它是选择性的,特异性的,快速的。”鲍尔补充说,她从这次实习中学到了很多东西,这对她的博士学位学习很有帮助。

目前在东安吉利亚大学设施中可用的分析范围还包括一些大分子的检测和测量,包括胶原蛋白分解产物。“骨肿瘤导致正常骨细胞降解,胶原蛋白分解并进入尿液;这些多肽的浓度可以在那里测量,这些形成了骨肿瘤有用的生物标志物,”达顿说。他预计,在未来几年内,包括蛋白质和多肽在内的更广泛的大分子检测方法将会出现。在接下来的几年里,其他可能的发展是灵敏度的进一步提高,允许测量到皮摩尔甚至飞摩尔浓度,当然,甚至更多的自动化。但他补充说,自动化是一种必要之恶。

进入阶段零

微小化合物浓度的敏感测量在一种相对新型的临床试验中是无价的:所谓的“研究性新药”或0期研究。通常,对一种潜在药物化合物的临床评估始于第一阶段试验,在该试验中,增加剂量的安全性进行测试,并为后续试验确定可能的起始剂量。只有在动物实验中确定了化合物的药代动力学后,第一阶段才能开始,这有时是非常困难的:例如,如果在不同物种上的测试产生非常不同的结果。0期临床试验的一个潜在目标是通过在人类受试者中测试微剂量来发现相同的信息。一般来说,小于100µg的小分子药物的典型剂量太低,不能产生毒性或治疗作用,但它的分布和代谢可以用定量质谱来阐明。

公司喜欢使用“快速失败,廉价失败”这句话,但他们仍然不喜欢“失败”这个词

制药巨头葛兰素史克公司(GSK)在一种治疗疟疾的候选药物GSK3191607的早期试验中使用了这种方法,该药物最终被停产。“在这项微剂量研究中,我们使用基于ms的加速器质谱(AMS)方法高精度地测量了药物浓度,这使我们能够估计其药代动力学参数,”GSK临床药理学负责人Malek Okour解释说。“我们发现它的消除半衰期相对较短,而且在更高级的试验或临床使用中,没有一种模拟治疗剂量方案有望使候选药物比类似化合物更有优势:因此,停止其开发的决定相对简单。”

Okour和他的同事在临床试验中使用加速器质谱(AMS)技术测量了受试者血浆中GSK3191607的浓度。这种技术包括将分子离子加速到极高的速度,从而使它们具有很高的动能。然后使用一种称为“剥离”的技术破坏共价键,通过单原子计数分离并检测单个离子。这使得稀有的原子同位素能够从丰富的邻近原子中分离出来。14C从12C)然后量化。AMS最常用于放射性碳测年,但它也有许多生物医学用途。在这个试验中,给药的药物中加入了微量的14C和血浆中药物浓度的测定14C浓度测量。

正如GSK转化医学部门董事、研究员格雷姆•杨(Graeme Young)解释的那样,GSK3191607的命运并不比消极的决定更有用或更重要。“公司喜欢使用‘快速失败,廉价失败’这句话,但他们仍然不喜欢‘失败’这个词。思考而不是“发现一个分子的真相”应该导致在早期阶段改进“去/不去”的决策,并通过限制对最终不成功的化合物的投资来降低药物开发成本。“随着质谱法进入第二个世纪,它应该成为这类决策以及更多临床和药物研究应用的更有用的工具。”

克莱尔·桑瑟姆,英国伦敦科普作家