超低温显微镜获得2017年诺贝尔化学奖

“这是一次非常令人困惑的经历。”约阿希姆·弗兰克哥伦比亚大学的新闻发布会上说他回忆起得知自己获得2017年诺贝尔化学奖的那一刻。“我本以为我会被我的新狗吵醒,但突然有个电话来了。”

就在弗兰克被叫醒的同时,理查德·亨德森来自英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室(LMB)的他正在一个电子显微镜会议上听演讲。然后他的电话响了。他说:“我当时想‘我正在开会,周围都是人,我现在不能说话’,所以我拒绝了这个电话。”但当他注意到电话是从瑞典打来的时,他就去回了电话。亨德森笑着说:“Meindert(另一位LMB研究员拉默斯)认为我出去有点粗鲁。”

Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson, 2017年诺贝尔化学奖获得者

来源:插图:Niklas Elmehed©Nobel Media AB 2017

雅克·杜波切特、约阿希姆·弗兰克和理查德·亨德森获得2017年诺贝尔化学奖

雅克Dubochet来自瑞士洛桑大学的弗兰克和亨德森因其“开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电子显微镜(cryo-EM)”的工作而获奖。

Cryo-EM让科学家们看到了生命机制——DNA、核糖体、蛋白质和病毒——在最逼真的状态下。这台超酷的显微镜几乎可以破译任何生物分子的结构。在x射线晶体学等方法的阴影下站立多年后,冷冻电镜现在是结构生物学中增长最快的领域之一。

但这是一条漫长的路。获奖者对冷冻电镜潜力的信念,以及他们克服挑战的决心,在几十年里为最终提供一种方法奠定了基础,现在比以往任何时候都更容易捕捉原子细节的生物结构。他说,这是一个实至名归的奖项,姗姗来迟斯蒂MacLellan-Gibson他曾是杜波切特团队的博士后,现在是英国南米姆斯国家生物标准与控制研究所的生物成像负责人。

从x到e

自20世纪50年代以来,当科学家们第一次开始观察生命的分子结构时,x射线晶体学一直是首选方法。今天,已有22个诺贝尔奖授予了通过x射线阐明的结构,包括DNA、肌红蛋白、离子通道和受体。

然而,正如它的名字所暗示的,它依赖于晶体:晶体固体中原子的规则排列。生物分子本质上不是刚性的,这通常使它们难以结晶或不可能结晶。在形成干晶体的过程中,蛋白质会被迫形成它们自然不会采用的形状。另一方面,Cryo-EM可以在没有3D晶体的情况下工作,并保留生命最重要的成分之一:水。

理查德·亨德森和细菌视紫红质的分子模型

资料来源:英国皇万博代理家化学学会

理查德·亨德森拿着一个基于他早期EM实验的细菌视紫红质模型。

在20世纪70年代早期,亨德森正在努力制造细菌视紫红质晶体,这是一种质子泵蛋白,存在于一些细菌的细胞膜上。从膜中分离出来的蛋白质只是失去了它的结构,没有晶体就意味着没有x射线晶体学。

然后在1973年,他回忆道:“我听了奈杰尔·昂温关于他努力改进电子显微镜的演讲。”由于电子的波长正好可以探测原子的细节,而且能够对x射线直接穿过的薄的2D样品进行成像,EM听起来像是研究他的蛋白质的完美方法。

发明于20世纪30年代,并获得了诺贝尔奖恩斯特Ruska在1987年,电子显微镜已广泛用于研究颜料、油漆、金属和其他非生物物质。但是电子显微镜不太适合生物分子:它需要高真空才能工作(这样电子束就不会被气体分子散射),这会使样品变干,电子束的能量会破坏共价键。“你基本上会烧掉整个分子,”解释说Sjors谢尔亨德森在LMB的同事说。

较低的电子剂量可以限制损伤,但这意味着对比度较弱。当时的一种解决方案是使用负染色法——在样品上涂上重金属盐。麦克莱伦-吉布森解释说:“污渍在蛋白质的外部形成了一层外壳。”她继续说:“你在外部得到了非常高的对比度,但它掩盖了内部结构,因为电子与(蛋白质周围的)原子相互作用,而不是与样品中的原子相互作用。”

亨德森和昂温对这种方法不满意;他们想绘制出细菌视紫红质的内部结构。他们制备了一种含有细菌视紫红质分子的脂质双分子层膜,并用葡萄糖溶液代替水,以防止水变干。弱电子束有助于将结构损伤降至最低。

该团队还利用了细菌视紫红质的不同寻常的特征:它实际上是一个2D晶体,在膜内自然地以高度规则的方式排列。这意味着,在整个样本中,任何对单个蛋白质的损害都可以忽略不计。

1975年,细菌视紫红质及其7个螺旋蛋白链成为第一个用电子显微镜解决的生物分子结构。1然而,在分辨率为7Å的情况下,要达到x射线晶体学的3Å分辨率还有一段路要走。又过了15年,亨德森才获得了细菌视紫红质原子结构的细节。2

lmbem室的透射电子显微镜

来源:©MRC分子生物学实验室

正在工作的电子显微镜。

不同的角度

虽然亨德森的突破利用了蛋白质的周期性结构,但其他样本包含随机分散的生物分子——都是不同方向的。

在电磁的早期,像德国慕尼黑马克斯·普朗克研究所的晶体学家沃尔特·霍普这样的科学家,试图用断层扫描来克服这个问题。这意味着通过从不同方向拍摄样本的快照来重建3D结构。弗兰克是霍普的博士生,他对导师的方法持批评态度:“他从一个我认为无效或完全错误的角度来研究这个想法,”弗兰克说。

断层扫描对多幅图像的要求意味着样品会多次受到高电子剂量的轰击,Frank解释道。“最后,你已经暴露了一个分子,以至于结果毫无意义。如果你用这样的东西来制作3D图像,你可能会忘记它。”

Frank的三维结构图像分析

弗兰克意识到,每个样本有数百万个分子,一个快照已经包含了许多不同的方向。他继续说,“这样你就不必倾斜分子了。”“它会自己倾斜,就是这个意思。舍勒斯解释说:“这些图像都非常嘈杂。”“但如果你有足够多的图像,你实际上可以对齐和平均它们。通过平均,信号保留下来,但噪音被平均掉了。”

20世纪80年代初,弗兰克和马林·范·赫尔当时是弗兰克实验室的访问学生,现在是巴西国家纳米技术实验室的研究员,他发表了一种统计计算方法,以不同的方向和状态对分子进行分组和平均。3.然而,一个问题仍然存在:如何将2D图像与3D结构联系起来?

重建现实

亨德森的LMB同事解释说:“你得到的图像实际上是一个2D投影。Lori Passmore.“这意味着所有的三维信息都被分解成二维;甚至是内在结构,”她继续说道。

Frank用随机锥形倾斜法重建了三维图像。4他拍了两张照片,一张是垂直于电子束的样品,另一张是倾斜的样品。这使他能够确定每个粒子朝向电子束的角度。一个正反傅里叶变换形式的数学技巧揭示了原始的3D对象(见下文)。

说明低温电子显微镜基本概念的图表

来源:施普林格Nature

低温电子显微镜的基本概念。二维投影在实空间的傅里叶变换对应于三维傅里叶空间的切片。使用不同角度的许多投影并结合2D切片,可以通过反傅里叶分析重建样品的完整3D结构。

“投影的二维傅里叶变换是通过原始物体的三维傅里叶变换得到的中心部分,”Scheres解释道。“通过从不同方向获得多个2D投影图像,如果你知道相对方向,你就可以把所有这些2D切片放回去,并通过傅里叶反分析进行重建。”

Frank编写了一个名为Spider(电子显微镜及相关领域图像数据处理系统)的计算机程序,进行倾斜角度分组和三维重建。51987年,他用它重建了细菌核糖体的一部分,证明了它的力量,6多年来,它一直是显微镜专家的最爱。直到最近,它才被其他程序取代,比如Scheres的Relion(正则似然优化),后者需要较少的编程专业知识。

液体冰

在弗兰克研究蜘蛛的同时,杜波切特刚刚在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室成立了自己的研究小组。杜波切特不喜欢使用干燥的标本,也不喜欢用葡萄糖或塑料树脂代替水。他想看到生物分子在自然、水化状态下的样子。杜波切特说:“如果没有水,分子就会像鱼一样死亡。在接受诺贝尔媒体采访时

“他从一开始就喜欢水,”他回忆道Alasdair McDowall他是美国加州理工学院(California Institute of Technology)新兴市场中心主任,当时曾与杜波切特共事。“水在他眼里是美丽的。必须如此,因为这就是生活的真谛。”

低温电镜样品制备程序

以前曾尝试使用冷却来阻止样品在显微镜的真空中脱水,以及保护它们免受辐射损害。问题是冷水会形成冰。除了破坏脆弱的生物结构外,晶体冰还会强烈地衍射电子束。大多数从冷冻样品中获取的EM图像都是无用的。

但如果冰不是晶体,那么它对电子来说几乎是完全透明的。因此,Dubochet的团队致力于将样品嵌入玻璃状的冰中——一种无定形的、玻璃状的冰冻水。在那之前,玻璃状的冰很少见,只在过冷金属上观察到薄层。水滴可以冻结成玻璃状冰的想法至少被认为是大胆的。

这并没有阻止Dubochet。他的团队使用自制的冷冻器(本质上是一个带有几根松紧带的蒸馏架),开始寻找一种可以快速冷却水,使其变成玻璃状的液体。麦克道尔解释说:“我们将样品放入不同的冷冻器中。”他回忆说:“我们查阅了有关有机低温剂的全部化学书籍,以便在尽可能低的温度下保持液态。”

“然后,有一天,一切都改变了,我称之为‘顿悟’时刻,一个人明白自己刚刚有了真正的发现的独特时刻,”杜波切特说瑞士日报说Le临时工.他的团队发现,乙烷被液氮冷却到-190°C是完美的。

他的团队最终发布了第一个有效的冷冻装置,由一个喷雾器和一个冷水浴组成。样品容器通过水滴喷射直接进入低温,然后从低温中提取并放置在同样低温的显微镜中。7

尽管Dubochet指出“我们仍然不了解用我们的方法玻璃化的水的性质”,他的方法将EM转化为冷冻EM。玻璃化的水成为方法学难题的最后一块,使研究人员首次获得了未染色生物分子的清晰图像。

原子来自团

帕斯莫尔解释说,到20世纪90年代初,低温电子显微镜在科学界已经有了一小部分追随者,但“它仍然很困难,人们通过使用晶体学或将两者结合起来,在理解生物学方面取得了更大的进展。”达到原子分辨率似乎是一个不可逾越的障碍。弗兰克说:“我们被困在了5到7埃左右。”

玻璃冰中GroEL粒子的电子显微镜图像

来源:作者:Vossman(个人作品)[GFDL或CC By - sa 4.0-3.0-2.5-2.0-1.0,通过维基共享资源

玻璃体冰中GroEL蛋白的电子显微镜图像。

亨德森回忆说,这被称为“blobology时代”。“你做了一个结构,你得到了一团东西——你看不出原子是什么,还没有化学反应。但他决心不放弃自己的梦想,尽管很少有人认同他的愿景。谢勒斯笑着说:“比如说,很多人都认为他有点乐观。

解决这些斑点依赖于另一个因素。当时,直到大约10年前,电子显微镜仍然使用照相胶片来捕捉图像,尽管必须冲洗和扫描每张照片——现有的数字传感器并没有直接捕捉电子,而是将电子信号转换为光信号,这增加了噪音。然而,照相胶片只能捕获大约四分之一的电子。“因为你必须非常小心地使用多少电子,这产生了非常嘈杂的图像,”Scheres解释道。

因此,当2012年直接电子探测器进入市场时,低温电子显微镜已经准备好了。结构分解到3Å以下-以前的x射线晶体学领域-不再不寻常,说布丽姬特卡拉格来自美国纽约结构生物学中心。2015年,她的团队破解了蛋白质降解复合物的结构2.8Å,8一年后,另一个小组解析出了蛋白质结构1.8Å。9

迄今为止被成像的最小结构之一是人类γ-分泌酶,这是一种膜酶,能产生聚集在阿尔茨海默病患者大脑中的短氨基酸丝。10在2016年寨卡病毒流行期间,研究人员在短短几个月内就成功地将病毒成像到3.8Å分辨率。11

寨卡病毒

资料来源:©Johan Jarnestad/瑞典皇家科学院

寨卡病毒的结构在短短几个月内就通过低温电子显微镜被破解了。

低温的胜利

亨德森说,在首次使用电子显微镜40多年后,“你现在可以或多或少地把任何东西放进显微镜里:单个粒子、病毒、2D晶体、3D晶体、细胞碎片、细胞器。”Cryo-EM还发展到包括第四个维度:时间。即时冷冻将分子保持在不同的动态状态,这给了科学家一个独特的机会来观察细胞的分子机制。有一些关于人类核糖体将遗传密码转化为蛋白质的电影12ATP合酶是一种分子涡轮机,将质子流转化为细胞的能量货币三磷酸腺苷。13

存入蛋白质数据库的冷冻电镜衍生结构的数量每年都在增加:2010年,只有53个结构存入了蛋白质数据库;2016年,这个数字超过了400。帕斯莫尔说:“低温电镜技术在过去五年中确实突飞猛进。”“你很少能看到一个领域移动得如此之快,就在你眼前发生变化。”

EM科学家正在把标准设得更高。卡拉格说,原位观察结构是新兴市场仅存的圣杯之一。未来的方法可能是聚焦离子束铣削,即使用扫描电子显微镜切割冻结样品的部分,直到只剩下一个小楔。麦克道尔说:“这将为了解蛋白质的去向、移动以及病毒在细胞内的所有活动提供一个巨大的机会,这些活动通常位于我们看不到的深层部位。”卡拉格补充说:“这项工作仍然非常具有挑战性,但非常令人兴奋,我们都期待着这一领域的新技术发展。”

噪声爱因斯坦

尽管复杂的计算工具可以从低分辨率的EM图像中提取出漂亮的3D结构,但它们也有缺陷。2013年,哈佛大学的研究人员声称已经阐明了一种关键HIV蛋白的结构一个-亨德森强烈反对这一说法,b范跟c而且斯苏d来自美国贝塞斯达癌症研究中心。

这三位科学家认为,哈佛大学的研究团队掉进了“噪音中的爱因斯坦”陷阱:在随机的背景噪音中寻找图像。范赫尔解释说:“你可以在随机的白噪音中找到任何你想要的东西。”自动粒子搜索——尤其是在给计算机提供参考结构的情况下——使得发现任何东西成为可能,即使样本根本不包含任何粒子。

哈佛团队反驳了这些批评,详细介绍了他们的图像提取方法是如何专门设计来避免这个问题的。他们认为,他们对6Å的分辨率不能使用以前的结构,以11Å分辨率作为参考。争端仍未解决。

今天的直接电子探测器非常灵敏,科学家们可以用肉眼看到结构,不再那么依赖计算机从噪声中区分分子。范希尔说:“我们现在做的事情完全没有参考依据。”不过他也警告说,计算机程序及其用户仍然容易产生偏见,可以从噪音中得出爱因斯坦的结论。e